О введении в действие Методических указаний МУК МЗ ПМР 4.2.3701-24 «Лабораторная диагностика коклюша и заболеваний, обусловленных другими бордетеллами»
Приказ
№ 867 от 29.11.2024
- 1. Ввести в действие на территории Приднестровской Молдавской Республики Методические указания МУК МЗ ПМР 4.2.3701-24 «Лабораторная диагностика коклюша и заболеваний, обусловленных другими бордетеллами» согласно Приложению к настоящему Приказу.
- 2. Направить настоящий Приказ на официальное опубликование в Министерство юстиции Приднестровской Молдавской Республики.
- 3. Настоящий Приказ вступает в силу со дня, следующего за днем его официального опубликования.
- Глава 1. Общие положения и область применения
- 1. Настоящие Методические указания (далее - МУК) определяют методические основы и алгоритмы лабораторной диагностики коклюша и заболеваний, обусловленных другими бордетеллами.
- 2. Настоящие МУК предназначены для учреждений Государственной санитарно-эпидемиологической службы Приднестровской Молдавской Республики, а также могут быть использованы научными и медицинскими организациями (далее - МО), осуществляющими диагностику коклюша и заболеваний, обусловленных другими бордетеллами.
- Глава 2. Сущность метода
- 3. Коклюш - острое инфекционное заболевание с воздушно-капельным механизмом передачи, своеобразным судорожным приступообразным кашлем и циклическим затяжным течением.
- 4. Для лабораторной диагностики коклюша и заболеваний, обусловленных другими бордетеллами, используют бактериологический, молекулярно-генетический и серологический методы исследования:
- 5. Диагноз заболеваний, обусловленных бордетеллами, устанавливают на основании выделения культуры возбудителя или дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее - ДНК) соответствующего возбудителя или выявления антител к возбудителю.
- Глава 3. Характеристика бактерий рода Bordetella
- 6. Возбудители коклюша и коклюшеподобных заболеваний относятся к роду Bordetella (семейство Alcaligenaceae, порядок Burkholderiales, класс Betaproteobacteria), включающему следующие виды: B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica,B. avium, B. hinzii, B. holmesii, B. trematum. Помимо этих видов, открыты еще пять бордетелл: B. petrii, B. ansorpii, B. bronchialis, B. flabilis, B. sputigena.
- 7. Устойчивость к факторам внешней среды.
- 8. Культурально-морфологические свойства.
- 9. Ферментативная активность микроорганизмов рода Bordetella определяется по их способности продуцировать ферменты каталазу, оксидазу, тирозиназу, уреазу, а также редуцировать нитраты в нитриты и расти на цитратном агаре Симмонса.
- 10. Антигенное строение и серологическая характеристика микроорганизмов рода Bordetella. Факторы патогенности B. Pertussis подразделяют на токсины и адгезины. К токсинам относят коклюшный токсин, аденилатциклазный токсин, трахеальный цитотоксин, дермонекротический токсин, липополисахаридный эндотоксин. К адгезинам - филаментозный гемагглютинин (далее - ФГА), агглютиногены, фимбрии, белок наружной мембраны пертактин и другие. Агглютиногены (далее - АГГ) - поверхностные белки, которые ответственны за выработку антител, агглютинирующих бактериальные клетки. У микроорганизмов рода Bordetella описано 16 АГГ, согласно таблице № 3 Приложения № 1 к настоящим МУК.
- 11. Показания к обследованию и критерии лабораторного подтверждения диагноза.
- 12. Классификация случаев заболевания коклюшем:
- 13. Окончательный диагноз коклюша устанавливается:
- 14. Сроки использования различных методов диагностики в зависимости от возраста и прививочного анамнеза представлены в таблице № 4 Приложения № 1 кнастоящим МУК.
- Глава 4. Организационно-методическая работа
- 15. Все работы по взятию, транспортировке и подготовке проб биологического материала, проведение бактериологических, ПЦР- и серологических исследований, сбору, хранению и утилизации отходов осуществляют в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями.
- 16. Взятие биологического материала проводится медицинским персоналом МО (врачами, средним медицинским персоналом) с использованием средств индивидуальной защиты (далее - СИЗ) - медицинской маски, респиратора, защитного экрана и других. Взятие биологического материала проводится в специально выделенном для этих целей помещении. В отдельных случаях допускается производить взятие материала на дому.
- 17. Биологический материал забирают натощак или через 2 - 3 часа после еды, до применения других видов исследования или процедур (в том числе полосканий), при хорошем освещении. В течение 6 (шести) часов перед процедурой не используют медикаменты, орошающие носоглотку или ротоглотку, и препараты для рассасывания во рту.
- 18. На доставляемый в лабораторию материал оформляется направление, в котором указывается:
- 19. Медицинский персонал МО (врачи, средний медицинский персонал), допущенный к взятию и посеву биологического материала, проходит входящий и затем повторный инструктаж на рабочем месте не реже 1 (одного) раза в 6 (шесть) месяцев. Инструктаж по взятию биологического материала проводит врач-инфекционист с привлечением врача-бактериолога (для инструктажа методики посева при бактериологическом исследовании) и регистрацией в соответствующем журнале с указанием подписей инструктируемого и инструктирующего и даты проведения инструктажа.
- 20. Бактериологические исследования проводятся врачами-бактериологами и биологами, прошедшими первичную специализацию по клинической лабораторной диагностике и периодическое повышение квалификации по специальности «Бактериология» в установленном законодательством порядке.
- 21. Результаты бактериологического, ПЦР- и серологического исследований оформляются в регистрационном и рабочем журналах в бумажной форме (возможно дублирование в электронной форме) и в бланке выдачи результатов. В бланке результатов указывается следующая информация:
- 22. Методическую помощь по вопросам взятия, транспортировки и лабораторной диагностики коклюша и заболеваний, обусловленных другими бордетеллами, осуществляют центры гигиены и эпидемиологии.
- Глава 5. Требования безопасности
- 23. Лаборатории, в которых проводятся работы с объектами и материалами, содержащими или подозрительными на содержание патогенных биологических агентов (далее - ПБА) III - IV групп патогенности, должны иметь лицензию на данный вид деятельности и санитарно-эпидемиологическое заключение в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями.
- 24. При выполнении бактериологических, ПЦР- и серологических исследований необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками по инструкции по эксплуатации прибора.
- 25. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксированном помещении, оборудованном бактерицидными лампами и боксами микробиологической безопасности II класса, в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями.
- Глава 6. Условия проведения исследований
- 26. Бактериологические, ПЦР- и серологические исследования проводятся с использованием необходимого оборудования, расходных материалов и реагентов (согласно приложениям № 2,3,4 к настоящим МУК).
- 27. Приготовление питательных сред и реактивов, проведение бактериологических, ПЦР- и серологических исследований осуществляют в следующих условиях:
- Глава 7. Бактериологическая диагностика: общие сведения
- Глава 8. Взятие биологического материала для бактериологического исследования
- 29. Исследуемым материалом является слизь из верхних дыхательных путей, осаждающаяся при кашле на задней стенке ротоглотки.
- 30. Взятие материала «кашлевыми пластинками» производят на 2 (две) чашки с питательной средой. Во время приступа кашля левой рукой снимают крышку чашки Петри, а правой подносят ее ко рту на расстоянии 10 - 12 см так, чтобы капельки слизи из дыхательных путей попали на поверхность питательной среды. Чашку в таком положении держат некоторое время (в течение 6 - 8 кашлевых толчков). При непродолжительном покашливании можно эту чашку поднести повторно. На питательную среду не должны попадать слюна, рвотные массы, мокрота. Затем чашку Петри с питательной средой закрывают крышкой и доставляют в лабораторию.
- Глава 9. Транспортирование биологического материала
- Глава 10. Бактериологическое исследование материала
- Глава 11. Порядок проведения бактериологического исследования
- 33. Бактериологическое исследование по продолжительности занимает до 7 (семи) дней.
- 34. Первый день исследования (посев биологического материала). Среды, предназначенные для посева и разлитые в чашки Петри слоем не менее 4 - 6 мм, предварительно асептически подсушивают одним из следующих способов:
- 35. Второй, третий или четвертый день исследования (выделение и накопление чистой культуры). Посевы начинают просматривать только с помощью микроскопа биологического стереоскопического (далее - МБС) с целью выявления и дальнейшего пересева подозрительных колоний.
- 36. Третий, четвертый или пятый день исследования (видовая идентификация). Просматривают посевы, произведенные с целью выделения чистой культуры, и проводят визуальную оценку изменения цвета питательной среды, осмотрев ее в проходящем свете.
- 37. Четвертый, пятый, шестой или седьмой день исследования (выдача окончательного ответа): на основании изучения характера роста и внешнего вида колоний и морфологии клеток в мазках, окрашенных по Граму, положительной реакции агглютинации с видовыми неадсорбированными и адсорбированными монорецепторными сыворотками к факторам 1, 12 и 14, а также результатов тестов, позволяющих оценить биохимические свойства испытуемой культуры, может быть выдан окончательный положительный ответ.
- Глава 12. Схема бактериологического исследования
- 38. Первый день: посев исследуемого биологического материала на среды выращивания и инкубирование в термостате при плюс (36 +/- 1) °C.
- 39. Четвертый, пятый, шестой или седьмой день:
- 40. Окончательный положительный ответ может быть выдан на 5 - 6 дни с формулировкой: «ОбнаруженыB. pertussis/B. holmesii/B. parapertussis/B. Bronchiseptica». Отрицательный ответ выдается на 7 (седьмой) день при отсутствии подозрительных колоний представителей рода Bordetellaи формулируется: «B. pertussis/B. holmesii/B. parapertussis/B. Bronchisepticaне обнаружены». Результаты исследования оформляются в соответствии с пунктом 21 настоящих МУК.
- Глава 13. Методики дифференциальной идентификации
- 41. Идентификацию бордетелл проводят путем постановки биохимических тестов.
- 42. Определение подвижности.
- 43. Определение тирозиназной активности.
- 44. Определение способности расти на цитратном агаре Симмонса.
- 45. Определение уреазной активности.
- 46. Определение нитратредуктазной активности.
- 47. Определение оксидазной активности.
- 48. Определение способности роста на простых питательных средах.
- 49. Окраска по Граму.
- 50. Серотипирование (сероидентификация) бактерий рода Bordetella проводится с применением коммерческих наборов реагентов. Серотипирование (сероидентификация) бактерий рода Bordetellaс использованием коммерческих наборов реагентов осуществляется строго в соответствии с инструкцией производителя.
- 51. Для взятия материала применяют два вида заднеглоточных тампонов: сухой и смоченный забуференным физиологическим раствором по прописи Кузнецова Е.А. (согласно пункту 54 настоящих МУК).
- 52. Сухие тампоны используются в следующих вариантах:
- 53. Увлажненные тампоны готовят из легко сгибающейся нержавеющей проволоки (лучше алюминиевой). Намотку ваты, сгибание и стерилизацию проводят так же, как указано для сухих тампонов, приготовленных в лабораторных условиях. Стерильные согнутые тампоны перед употреблением смачивают в забуференной смеси по прописи Кузнецова Е.А. (согласно пункту 54 настоящих МУК) путем двукратного погружения в пробирку с жидкостью. После смачивания тампона его помещают в стеклянную пробирку, а затем используют для взятия материала. Влажные тампоны в стеклянных пробирках хранят 3 (три) дня при температуре плюс (2 - 8) °C.
- 54. Раствор для смачивания тампонов (по прописи Кузнецова Е.А.) в конической колбе смешивают 90 - 95 мл предварительно приготовленного раствора Na2HPO4 (11,876 г на 1 л дистиллированной воды) и 5 - 10 мл раствора KH2PO4 (9,078 г на 1 л дистиллированной воды). К этой смеси добавляют 0,5 г агар-агара, стерилизуют 20 (двадцать) минут при 1 атм. Затем в горячую смесь добавляют 0,2 г активированного угля (навеску угля стерилизуют отдельно). Смесь готовят с расчетом на несколько применений и хранят при температуре плюс (2 - 8) °C до 2 (двух) месяцев.
- 55. Основными средами для выделения бордетелл являются питательная среда для культивирования и выделения коклюшного микроба сухая Бордетелагар, КУА, картофельно-глицериновый агар (среда Борде-Жангу).
- 56. Среды для первичного посева биологического материала:
- 57. Приготовление Бордетелагара.
- 58. Компоненты, входящие в состав КУА, представлены в таблице № 2 Приложения № 5 к настоящим МУК.
- 59. Картофельно-глицериновый агар (среда Борде-Жангу).
- 60. Добавки для подавления роста сопутствующей микрофлоры. Для подавления посторонней микрофлоры при посеве исследуемого материала используют пенициллин или бициллин. Их применяют как при обработке поверхности питательной среды, разлитой в чашки Петри, так и при внесении в среду. Можно использовать цефалексин, применяемый в мировой практике.
- 61. Возможны два способа применения антибиотика:
- 62. Цефалексин используется в концентрации 40 мг/л среды. Он производится как селективная добавка для бордетелл.
- 63. Среда для определения подвижности.
- 64. Среда для определения тирозиназной активности (питательный агар с тирозином). Для определения тирозиназной активности используют питательный агар с добавлением тирозина.
- 65. Среды и реактивы для определения уреазной активности. Определение уреазной активности можно осуществлять следующими способами:
- 66. Цитратный агар Симмонса.
- 67. Среды и реактивы для определения нитратредуктазной активности (приготовление нитратного бульона). К 100 мл стерильного питательного бульона (ГРМ-бульона, МПБ или бульона Хоттингера) (pH 7,3 - 7,5), свободному от нитритов (проверить реактивом Грисса (Касаткина)), прибавляют 0,1 г свободного от нитритов нитрата калия. Проверяют еще раз на содержание нитритов и разливают по 2 - 3 мл в стерильные, химические чистые, сухие пробирки. Среды стерилизуют 15 (пятнадцать) минут при плюс (121 +/- 1) °C.
- 68. Реактив Грисса (приготовление реактива Грисса):
- 69. Реактив Касаткина (приготовление реактива Касаткина):
- 70. Реактивы для оксидазного теста.
- 71. Красители.
- 72. Перечень контрольных штаммов.
- 73. Хранение контрольных штаммов в лабораторных условиях.
- 74. Подготовка контрольных штаммов бордетелл для оценки качества питательных сред и реагентов:
- 75. Для поддержания высокого качества и эффективности проведения лабораторной диагностики коклюша и заболеваний, обусловленных другими бордетеллами, в лабораториях, осуществляющих исследования, проводится внутрилабораторный контроль качества, который регистрируется в соответствующих журналах.
- 76. При длительном использовании одной серии сред, реактивов и наборов реагентов внутрилабораторный контроль качества необходимо проводить 1 (один) раз в квартал.
- 77. К контрольным штаммам микроорганизмов относятся:
- 78. Контроль качества питательных сред для культивирования бактерий рода Bordetella.
- 79. Внутрилабораторный контроль качества сред для определения биохимических свойств проводят путем определения степени выраженности и времени формирования признака у контрольных штаммов (положительные контроли) и отсутствие реакции в отрицательных контролях.
- 80. Оценка качества сред и постановки пробы для определения подвижности:
- 81. Оценка качества сред (реактивов, реагентов) и постановки пробы для определения тирозиназной активности.
- 82. Оценка качества сред (реактивов и реагентов, наборов реагентов) и постановки пробы для определения уреазной активности:
- 83. Оценка качества сред (реактивов и реагентов, наборов реагентов) и постановки пробы для определения нитратредуктазной активности:
- 84. Оценка качества сред (реактивов, реагентов) и постановки пробы для определения способности расти на цитратном агаре Симмонса:
- 85. Оценка качества реактивов и реагентов (наборов реагентов) и постановки пробы для определения оксидазной активности:
- Глава 14. Молекулярно-генетическая диагностика
- 86. Молекулярно-генетическая диагностика применяется при обследовании пациентов с различными формами клинического течения болезни на 1 (первой) – 4 (четвертой) неделях от начала заболевания как с диагностической целью, так и по эпидемиологическим показаниям.
- 87. Взятие биологического материала проводится согласно пунктам 15-17 настоящих МУК.
- 88. Материалом для ПЦР-исследования на коклюш у детей и взрослых служит слизь из верхних дыхательных путей, осаждающаяся при кашле на задней стенке ротоглотки. Взятие клинического материала осуществляют через ротовую полость с задней стенки ротоглотки последовательно двумя сухими стерильными зондами из полистирола с вискозными тампонами (или универсальными велюр-тампонами на пластиковом аппликаторе с нейлоновым наконечником). Сначала необходимо аккуратно прижать язык пациента индивидуальным шпателем. Чтобы стимулировать кашель, первый сухой стерильный зонд вводят в ротовую полость и, не касаясь щек и языка, проводят по задней стенке ротоглотки. После откашливания второй зонд вводят через рот и собирают слизь тампоном с задней стенки ротоглотки. У детей раннего возраста (1 - 2 месяца) допускается взятие материала с помощью педиатрических велюр-тампонов. После взятия материала часть зонда с тампоном помещают в одну пробирку объемом 2 мл с 0,5 мл физиологического раствора или транспортной среды для ПЦР. Рукоятку зондов отламывают движениями вниз-вверх-вниз, придерживая тампоны (зонд из полистирола с вискозным тампоном погружают на глубину 1,0 - 1,2 см, универсальный велюр-тампон - на 3 см до места слома) сверху крышкой пробирки. Оба зонда объединяют в одну пробу и исследуют как одну пробу. Пробирку герметично закрывают, маркируют и помещают в индивидуальный полиэтиленовый пакет.
- 89. Дополнительным материалом для ПЦР-исследования (с целью дифференциальной диагностики с респираторно-вирусными инфекциями) может служить мазок со слизистой носоглотки, собираемый назофарингеальным велюр-тампоном через нижний носовой ход. В этом случае у пациента берут два мазка с помощью 2 (двух) разных зондов - сначала мазок со слизистой задней стенки ротоглотки (описанным выше способом), затем - мазок из носоглотки. Зонды отламывают последовательно в одну и ту же пробирку с физиологическим раствором или транспортной средой и исследуют как одну пробу.
- 90. Допускается хранение биологического материала в течение 3 (трех) суток при температуре плюс (2 - 8) °C, более длительно - при температуре не выше минус 16 °C.
- 91. Пробирка с биологическим материалом проверяется визуально на герметичность и маркируется в соответствии с прилагаемым списком в направлении (согласно пункту 18 настоящих МУК).
- 92. При необходимости транспортирования внутри одного здания пробирки с биологическим материалом помещают в штативы и специальные герметичные контейнеры-переноски. Транспортирование производится при комнатной температуре или при температуре плюс (2 - 8) °C.
- 93. Медицинский персонал МО проводит исследования методом ПЦР в соответствии с инструкциями, правилами безопасности, изложенными в технических паспортах к приборам и в инструкциях к диагностическим наборам реагентов.
- 94. Исследование проводится с применением наборов реагентов, зарегистрированных и разрешенных для использования на территории Приднестровской Молдавской Республики.
- 95. Анализ является однонаправленным, и разные его этапы проводятся в отдельных помещениях - зонах. Работа начинается в зоне экстракции нуклеиновых кислот, продолжается в зонах амплификации и детекции. Образцы, оборудование и реактивы не возвращаются в зону, в которой была проведена предыдущая стадия процесса. Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы являются стационарными - их не переносят из 1 (одного) помещения в другое. Неиспользованные реактивы, реактивы с истекшим сроком годности, а также использованные реактивы утилизируются.
- 96. Непосредственно перед исследованием содержимое закрытой пробирки с мазками требуется тщательно перемешать на вортексе, придерживая крышку пробирки, и центрифугировать в течение 5 (пяти) секунд при 5000об. /мин на микроцентрифуге с целью удаления капель с внутренней поверхности крышки пробирки. Затем следует открыть пробирку и, не извлекая зондов, отобрать необходимое количество образца для исследования.
- 97. Порядок проведения ПЦР-исследования и интерпретация результатов анализа осуществляется в соответствии с инструкцией изготовителя используемого набора реагентов.
- 98. ПЦР является методом молекулярно-генетической диагностики, позволяющим обнаруживать специфичные участки генома бактерий. В его основе лежит амплификация, то есть многократное увеличение количества фрагмента ДНК возбудителя. Цикличность реакции достигается путем многократного (от 40 (сорока) до 45 (сорока пяти) раз) последовательного повторения шагов инкубации реакционной смеси при температурах плюс (90 - 95) °C (денатурация ДНК), плюс (50 - 65) °C (отжиг праймеров), плюс (60 - 72) °C (элонгация или синтез цепи ДНК).
- 99. Для диагностики коклюшной инфекции могут применяться варианты ПЦР, различающиеся способом детекции фрагментов амплификации: ПЦР с детекцией методом электрофореза, с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (далее - ПЦР-РВ) или по окончании ПЦР (далее - ПЦР-КТ).
- 100. С целью упрощения и ускорения анализа результатов можно использовать программное обеспечение, рекомендованное производителем диагностического набора реагентов.
- 101. Результатом анализа могут быть следующие варианты, формулируемые в заключении в зависимости от типа и специфичности используемой тест-системы:
- 102. Отчетная документация оформляется на бумажном и электронном носителях в виде отчетов по результатам экспериментов, формируемых программой для анализа результатов ПЦР (видеосистемой при детекции методом электрофореза), которые должны содержать коды и результаты исследования биологических образцов пациента и контрольных образцов. Файлы постановок экспериментов сохраняются на электронном или бумажном носителях в течение 3 (трех) лет в соответствии с законодательством Приднестровской Молдавской Республики.
- 103. Результаты ПЦР-исследования учитываются в совокупности с клинико-эпидемиологическими данными на пациента.
- 104. С целью предотвращения появления недостоверных, в том числе ложноположительных, результатов необходимо соблюдать требования по организации лаборатории, правила работы персонала с оборудованием и реактивами и требования, указанные в инструкции и методических рекомендациях производителей конкретного набора реагентов. Характеристики диагностических наборов, установленные разработчиком, воспроизводятся при условии соблюдения всех требований и рекомендаций, включая использование оборудования, комплектов реагентов, соблюдение всех этапов и процедур исследования от момента сбора биологического материала до интерпретации результатов.
- 105. При проведении исследования используются положительные и отрицательные контроли для всех этапов анализа. Результаты ПЦР-исследования считаются достоверными, если получены правильные (в соответствии с инструкцией к используемому набору реагентов) результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК.
- 106. С целью обеспечения внутрилабораторного контроля качества ПЦР-анализа периодически (не реже 1 (одного) раза в месяц) и незамедлительно при подозрении на загрязнение лаборатории фрагментами амплификации ДНК (появление положительной реакции в отрицательных контрольных образцах ПЦР) требуется проводить контроль контаминации лаборатории продуктами ПЦР путем взятия смывов (согласно Приложению № 6 к настоящим МУК).
- Глава 15. Серологическая диагностика
- 107. Серологическую диагностику коклюша проводят методом ИФА с использованием наборов реагентов для определения уровня специфических противококлюшных антител классов M, A и G (IgM, IgA, IgG). В тест-системах ИФА в качестве антигенов использованы обогащенные фракции коклюшного токсина или коклюшного токсина и ФГА.
- 108. Исследование проводят начиная с 3 (третьей) недели болезни.
- 109. Для исследования используется сыворотка крови. Возможно использование плазмы крови, если это указано в инструкции производителя тест-системы для постановки ИФА.
- 110. Взятие крови проводят натощак из вены в объеме 3 - 4 мл в стерильную пробирку - сухую или вакуумную пробирку с разделительным гелем. Также кровь можно взять из подушечки третьей фаланги среднего пальца в объеме 0,5 - 1,0 мл (у детей младшего возраста) в стерильную пробирку - сухую или с активатором свертывания сгустка.
- 111. Пробу крови отстаивают при комнатной температуре в течение 30 (тридцати) минут или помещают в термостат при плюс (37 +/- 1) °C на 15 (пятнадцать) минут. Затем проводится центрифугирование в течение 10 (десяти) минут при 3000 об. /мин. По окончании центрифугирования сыворотку переносят в отдельную пробирку (например, типа «Эппендорф»).
- 112. Образцы сывороток крови хранятся при комнатной температуре плюс (18 - 25) °C в течение 6 (шести) часов, при температуре плюс (2 - 8) °C - в течение суток. Для более длительного хранения образцы необходимо разделить на аликвоты и заморозить при температуре не выше минус 16 °C. Многократное замораживание (размораживание) сыворотки крови недопустимо.
- 113. Пробирка с биологическим материалом визуально проверяется на герметичность и маркируется в соответствии с прилагаемым списком в направлении (согласно пункту 18 настоящих МУК).
- 114. При необходимости транспортирования внутри одного здания пробирки с биологическим материалом помещают в штативы и специальные герметичные контейнеры-переноски. Транспортирование производится при комнатной температуре или при температуре плюс (2 - 8) °C.
- 115. При необходимости транспортирования биологического материала в другие организации образцы от каждого пациента помещают в индивидуальный герметичный пакет и дополнительно упаковывают в общий герметичный пакет подходящего размера с адсорбирующим материалом в количестве, достаточном для адсорбции всего образца в случае его утечки. Пакет герметично закрывают. Полиэтиленовый пакет помещают в термоизолирующий контейнер (сумку-холодильник), приспособленный для транспортирования биологических материалов, и транспортируют при температуре плюс (2 - 8) °C, соблюдение которой (по возможности) контролируется специальными индикаторами.
- 116. Для исследования используется сыворотка крови. Возможно использование плазмы крови, если это указано в инструкции производителя. Не допускается использование мутных вследствие липемии и гемолизированных образцов. Такие образцы перед исследованием должны быть процентрифугированы при 3000 тысяч об. /мин в течение 10 (десяти) минут.
- 117. Постановка ИФА осуществляется согласно инструкции производителя диагностического набора.
- 118. Перед началом работы тест-систему достают из холодильника, открывают крышку и оставляют на столе на 30 (тридцать) минут для того, чтобы все компоненты набора были доведены до комнатной температуры. Затем достают все реактивы, необходимые для постановки. Разрезают алюминиевый пакет выше «застежки-молнии» и достают необходимое количество стрипов, помещают в рамку, закрывают крышкой и оставляют на столе. После каждого взятия стрипов алюминиевый пакет должен плотно закрываться вместе с влагопоглощающей прокладкой.
- 119. Исследуемые образцы сывороток перемешивают на вортексе (3000 об. /мин) и разводят согласно прилагаемой инструкции к тест-системе (как правило, это разведения 1:100 или 1:50) в пробирках или в плашке для предварительного разведения. Для определения IgM в некоторых тест-системах требуется предварительная инкубация с IgG/RF-адсорбентом в течение 15 - 20 минут. Далее исследуемые образцы сывороток и контроли вносят в плашку по схеме, предлагаемой в инструкции, и инкубируют заклеенными инкубационной пленкой в термостате при плюс (37 +/- 1) °C необходимое время (30 (тридцать) или 60 (шестьдесят) минут).
- 120. Приготовление промывочного буфера производят согласно инструкции, прилагаемой к тест-системе. Для этого одну часть концентрата промывочного буфера (10x) смешивают с девятью частями (1 + 9) дистиллированной или деионизованной воды (например, 50 мл концентрата промывочного буфера (10x) - с 450 мл воды) или одну часть концентрата (20x) с девятнадцатью частями (1 + 19) дистиллированной или деионизованной воды (например, 50 мл концентрата промывочного буфера (20x) - с 950 мл воды). На каждый стрип необходимо 10 мл разведенного промывочного буфера.
- 121. После окончания инкубации плашку помещают в вошер для промывания, производят необходимое количество промывок (3 или 4 в объеме 300 мкл) согласно инструкции, после которых плашку переворачивают на фильтровальную бумагу для удаления оставшегося промывочного буфера.
- 122. На следующем этапе в плашку вносят конъюгаты для выявления специфических IgM, IgA и IgG. Конъюгаты могут быть в готовом для использования виде или требуют предварительного разведения (например, 1:300 или другое). Необходимое количество конъюгата отбирается из флакона чистым наконечником, помещается в чистую кювету и вносится в плашку (остатки конъюгата сливать обратно во флакон нельзя). Для каждого конъюгата (IgM, IgA, IgG) используется чистая кювета, предварительно маркированная. Плашку с конъюгатом, заклеенную инкубационной пленкой, инкубируют в термостате при плюс (37 +/- 1) °C или оставляют при комнатной температуре плюс (18 - 25) °C на необходимое время (30 (тридцать) или 60 (шестьдесят) минут) согласно инструкции. Затем производят промывку в вошере (3 (три) или 4 (четыре) раза в объеме 300 мкл), переворачивают на фильтровальную бумагу для удаления оставшегося промывочного буфера.
- 123. На следующем этапе в плашку вносят субстратный буфер - ТМБ (тетраметилбензидин) и помещают в термостат при плюс (37 +/- 1) °C или оставляют при комнатной температуре плюс (18 - 25) °C закрытыми крышками на необходимое время согласно инструкции (15 (пятнадцать) или 30 (тридцать) минут). По окончании инкубации реакцию останавливают внесением в лунки плашки стоп-реагента согласно инструкции. Считывание результатов проводят на микропланшетном фотометре при длине волны 450 нм или при двух длинах волн (450 и 620 - 650 нм). Перед фотометрическим считыванием необходимо очистить наружную поверхность дна лунок и проследить, чтобы в лунках отсутствовали воздушные пузырьки. Считывание необходимо производить в течение 15 (пятнадцати) минут после добавления стоп-раствора.
- 124. Интерпретация полученных результатов проводится согласно инструкции, прилагаемой к тест-системе. Полученные результаты могут выражаться в Ед./мл, индексе COI или в других показателях.
- 125. Отрицательный результат серологического исследования не исключает инфицирование возбудителем коклюша. Результаты серологических исследований интерпретируют в совокупности с клинической картиной болезни.
- 126. Тактика серологического исследования и интерпретация результатов должна строиться с учетом закономерностей формирования иммунного ответа у непривитых и привитых лиц.
- 127. У непривитых детей в начале острой стадии коклюша формируются IgM, которые можно выявить начиная со 2 (второй) недели болезни. Отрицательный результат по определению антител этого класса в первые 2 (две) недели не исключает инфицирование возбудителем коклюша, так как отрицательный результат теста может быть связан с низким уровнем антител. Острый процесс и прогрессирование заболевания сопровождается появлением IgA и IgG на 2 - 3-й неделе заболевания.
- 128. У детей, привитых против коклюша, в том числе утративших со временем поствакцинальные антитела, иммунный ответ формируется по вторичному типу: на 2 - 3-й неделе заболевания происходит интенсивное нарастание IgG, уровень которых превышает пороговый в 4 (четыре) и более раз, или на фоне низкой продукции IgM происходит быстрое нарастание IgA, а в дальнейшем IgG в показателях, превышающих референсный пороговый уровень в 4 (четыре) и более раз. В случае получения отрицательных результатов исследование повторяют через 14 (четырнадцать) и более дней.
- 129. У взрослых иммунный ответ на инфицирование может проходить как по первичному типу с образованием IgM, IgA и IgG, так и по вторичному типу с интенсивным нарастанием IgG и IgA, причем вторичный тип иммунного ответа является доминирующим. Уровень IgA может достигать высоких значений и превышать уровень IgG. Порядок обследования взрослых такой же, как для непривитых и привитых детей.
- 130. Выдача ответа осуществляется согласно пункту 21 настоящих МУК.
- 1. Процедуру рекомендуется проводить с необходимой периодичностью в зависимости от интенсивности работы (не реже,чем 1 (один) раз в месяц; при ежедневном проведении исследований 1 (один) раз в неделю) либо в случае получения положительных сигналов при амплификации отрицательных контролей этапов ПЦР.
- 2. Взятие смывов проводят в первой половине рабочего дня. Контрольные точки для смывов должны включать: рабочие и контактные поверхности лабораторного оборудования (автоматические дозаторы, центрифуги, микроцентрифуги (вортексы), амплификаторы, термостаты, холодильники); поверхности лабораторных материалов (штативы, пакеты с реактивами, упаковки расходных материалов, ножницы, пинцеты, маркеры и другое); рабочие и контактные поверхности лабораторных столов, боксов, ламинарных шкафов; прочие контактные поверхности (ручки дверей, кнопки компьютеров, компьютерные мыши, телефоны, компьютерные столы, прочая лабораторная мебель). При наличии отдельных помещений для размещения амплификаторов забор производится из тех же точек.
- 3. Необходимые материалы:
- 4. Список контрольных точек, с которых производится взятие смывов:
- 5. Процедура взятия смывов:
- 6. Порядок взятия смывов с каждой контрольной точки:
- 7. ПЦР-исследование полученных смывов с контрольных точек проводится в обычном порядке по инструкции к набору реагентов, начиная с этапа амплификации ДНК. Для этого в пробирку, подготовленную к амплификации, вместо необходимого объема ДНК вносится жидкость образца смыва исследуемой контрольной точки. С целью экономии реагентов перед проведением ПЦР допустимо объединять в отдельной пробирке (пулировать) по 10 мкл образцы смывов с контрольных точек в одной зоне (например, в ламинарном шкафу, в ПЦР-боксе, с приборов для ПЦР и так далее) и затем исследовать как один образец. При получении положительных результатов какого-либо пула для уточнения источника контаминации необходимо исследовать отдельные точки, входившие в пул.
- 8. Все результаты проведения смывов с целью контроля контаминации лаборатории продуктами ПЦР регистрируются в специальном журнале.
- 9. Интерпретация результатов исследования смывов с контрольных точек.
Реквизиты документа
Полное наименование
О введении в действие Методических указаний МУК МЗ ПМР 4.2.3701-24 «Лабораторная диагностика коклюша и заболеваний, обусловленных другими бордетеллами»
Издатель
Министерство здравоохранения
Вид акта
Приказ
№ документа
№ 867
Редакция
Первоначальный документ
Дата документа
29.11.2024
Скачать
Доступно по тарифу
К карточке документа
Карточка документа
О введении в действие Методических указаний МУК МЗ ПМР 4.2.3701-24 «Лабораторная диагностика коклюша и заболеваний, обусловленных другими бордетеллами»
Тип:
Приказ
Номер:
№ 867
Статус:
Опубликован
Редакция:
Первоначальный документ
Организация:
Министерство здравоохранения
Дата:
29.11.2024