На главную
О введении в действие МУК МЗ ПМР 4.2.026-13 «Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах»
Приказ
№ 137 от 20.03.2013
САЗ 13-13
- 1. Ввести в действие на территории Приднестровской Молдавской Республики методические указания МУК МЗ ПМР 4.2.026-13 «Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах» (прилагаются).
- 2. Контроль за исполнением настоящего Приказа возложить на Главного врача ГУ «Республиканский центр гигиены и эпидемиологии» - Печул А.С.
- 3. Настоящий Приказ вступает в силу со дня официального опубликования.
- 1. Область применения
- 1. Настоящие методические указания (далее - МУК) разработаны в соответствии с Законом Приднестровской Молдавской Республики от 3 июня 2008 года № 481-З-IV «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» (САЗ 08-22) с изменением и дополнениями, внесенными Законом Приднестровской Молдавской Республики от 6 августа 2009 года № 838-ЗИД- IV (САЗ 09-32), в целях дальнейшего совершенствования санитарно-эпидемиологического обеспечения населения Приднестровской Молдавской Республики.
- 2. МУК устанавливают экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах (далее - метод) по микробиологическим показателям безопасности для здоровья человека, проводимых в порядке производственного контроля, государственного санитарно-эпидемиологического надзора, а также при испытании пищевых продуктов в целях сертификации.
- 3. МУК предназначены для применения в бактериологических производственных, испытательных лабораториях и лабораториях учреждений Государственной санитарно - эпидемиологической службы Министерства здравоохранения Приднестровской Молдавской Республики (далее - Госсанэпидслужба) и позволяют проводить контроль на соответствие СанПиН МЗ и СЗ ПМР 2.3.2.1078-09 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», утвержденным Приказом Министерства Промышленности Приднестровской Молдавской Республики от 29 июня 2009 года № 338 (регистрационный № 5070 от 30 ноября 2009 года) (САЗ 09-49).
- 2. Сущность метода
- 4. МУК содержат описание ускоренного метода качественного и количественного обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах и других субстратах, основанного на подавлении антибиотиком дегидрогеназной активности тест - культур в жидкой питательной среде.
- 5. Дегидрогеназы - ферменты активируют процессы дыхания в живой клетке. Повреждение дегидрогеназ приводит к нарушению окислительно-восстановительных процессов и гибели клетки.
- 6. Высокая чувствительность этих ферментов к неблагоприятным воздействиям использована для выявления повреждающего действия антибиотика на различные тесткультуры. В методе используется способность клеток тест-культур восстанавливать метиленовый синий в анаэробных условиях. Если антибиотик оказывает цитотоксическое действие, клетки тест - культур лишаются такой возможности и метиленовый синий не восстанавливается. Метиленовый синий играет в этой системе одновременно роль акцептора водорода и индикатора, позволяющего судить о повреждающем действии антибиотиков на клеточные дегидрогеназы за определенный отрезок времени.
- 7. Преимущество экспресс-метода заключается в возможности получения ответа через 4 - 5 часов, относительной простоте и значительной экономии питательной среды.
- 8. Методика может быть осуществлена как в качественном, так и в количественном варианте, при этом при подсчете концентрации выявленного загрязнения используется титрационный принцип, в определенной степени облегчающий постановку анализа в баклабораториях и позволяющий получить достоверные результаты без построения стандартной кривой или расчета по таблицам активности антибиотиков.
- 9. Лабораторный контроль, позволяющий выявить непосредственные источники загрязнения, принимать меры, снижающие контаминацию продуктов и, соответственно, риск для потребителей, целесообразно, главным образом, осуществлять в первичном звене получения животноводческой продукции: на молочно-товарных фермах, птицефабриках, в убойных и мясо-перерабатывающих цехах хозяйств, сельскохозяйственных предприятиях, получающих и перерабатывающих продовольственное сырье животного происхождения. Готовая животноводческая продукция также должна контролироваться путем периодического отбора на молочных заводах, мясокомбинатах, птицеперерабатывающих заводах.
- 10. Допустимое содержание антибиотиков в продуктах не должно превышать для тетрациклинов 0,01 ЕД, пенициллина 0,01 ЕД, для стрептомицина 0,5 ЕД на 1 г (см³) продукта.
- 11. Метод состоит из нескольких этапов:
- 3. Подготовка проб к исследованию при качественном определении
- 12. Молоко и сливки жидкие (в сыром или пастеризованном виде): сырое молоко желательно подвергать исследованию в день отбора, как можно быстрее после получения (отбор на фермах); до начала анализа сохранять в холодильнике при температуре (4 ± 1) °С. Пробу в объеме не менее 10 см³ переносят в пробирку.
- 13. Сухие молочные продукты (сухое молоко, сухие сливки, сухие детские молочные продукты, изготовленные на основе коровьего молока): непосредственно перед исследованием продукты подвергаются восстановлению в кипяченой воде при температуре не выше (45 ± 1) °С в соответствии с указаниями на этикетке. Образцы тщательно перемешивают, они не должны содержать нерастворенных частиц или комков. Из восстановленного продукта отбирают пробы для анализа в объеме не менее 10 см³.
- 14. Яйца, меланж: яйца, предназначенные для исследования, предварительно прогревают на водяной бане при температуре (65 ± 1) °С в течение 10 -15 минут до коагуляции белка, затем полностью смешивают содержимое яйца, от которого отбирают пробы для анализа в объеме не менее 10 см³.
- 15. Мясо и субпродукты (печень, почки, язык и другие) скота и птицы, предназначенные для исследования, измельчают при помощи мясорубки или гомогенизатора, помещают полученный фарш в чашку Петри и дают стечь тканевому соку. Тканевой сок в объеме не менее 10 см³ переносят в пробирку.
- 16. Термическая обработка проб пищевых продуктов.
- 4. Подготовка проб к исследованию при количественном определении
- 5. Получение и хранение взвеси клеток тест - культур
- 19. Тест - культурами служат вегетативные формы спорообразующих и неспорообразующих культур: Вас. subtilis, вар. 6633; Вас. subtilis, вар. L2; Вас. mycoides 537; Micrococcus luteum ATCC 9341, обладающих высокой чувствительностью к антибиотикам.
- 20. Для определения пенициллина и стрептомицина предпочтительно пользоваться спорообразующими тест - культурами: Вас. subtilis, вар. 6633; Вас. mycoides 537 u Micrococcus luteum ATCC 9341; для тетрациклина - Вас. subtilis, вар. L2.
- 21. Вначале тест - культуру рассевают на чашки с 2 %-ным мясо - пептонным агаром для получения отдельных колоний. Чашки ставят в термостат при температуре (37 ± 1) °С на 20 ± 3 часа. После чего мелкие колонии отсевают в пробирки с 2 %-ным мясо-пептонным скошенным агаром и вновь инкубируют в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 20 ± 3 часа.
- 22. Микробную взвесь готовят путем смыва физиологическим раствором суточной культуры со скошенного агара. Важно, чтобы смыв культур был гомогенным и не содержал комочков. Полученную взвесь хранят в холодильнике при температуре (4 ± 1) °С не более 7 дней.
- 6. Определение «рабочей дозы» тест - культур
- 23. Поскольку количество жизнеспособных клеток тест - культуры от смыва к смыву варьирует, предварительно необходимо определить «рабочую дозу» тест - культуры, то есть наибольшее разведение суспензии, вызывающее обесцвечивание метиленового синего в определенное время в термостате при температуре (37 ± 1) °С. Следует учитывать, что время обесцвечивания метиленового синего обратно пропорционально количеству клеток в смыве.
- 24. Для постановки реакции выбрано время обесцвечивания, равное 1 часу. Это время, будучи величиной постоянной, выявляет в суспензиях различной плотности одну и ту же клеточную нагрузку для каждой тест - культуры в отдельности. «Рабочую дозу» тест - культур устанавливают по дегидрогеназной активности клеток.
- 25. Методика определения «рабочей дозы» тест - культуры.
- 7. Количественное определение концентрации антибиотиков и расчет активности
- 26. При определении концентрации антибиотика в пищевых продуктах параллельно ставят контрольный ряд с известным содержанием антибиотика в пробирках. Для этого навеску стандарта антибиотика (1 мг) растворяют в 1 см³ соответствующего буфера, получая, таким образом, основной раствор стандарта 1000 мкг/см³. Затем основной раствор десятикратно разводят до получения 100 мкг/см³ и 10 мкг/см³. Далее концентрации, с которых начинается титрование стандарта в контрольном ряду (2,0; 1,0; 0,5 мкг/см³ и так далее), разводят соответствующими буферными растворами.
- 27. Максимальное разведение тест-культур, вызывающее полное обесцвечивание метиленового синего и выявленное через 1 час инкубации в термостате при 37 °С, принимают за «рабочую дозу».
- 28. Титрование стандарта антибиотика и испытуемых образцов проводят путем двукратных разведений в объеме 0,5 см³ мясо - пептонного бульона. Последняя пробирка в контрольном ряду не содержит антибиотик и служит контролем дегидрогеназной активности клеток тест - культуры.
- 29. После этого во все пробирки вносят 0,5 см³ взвеси, содержащей двойную «рабочую дозу» тест - культуры, то есть предпоследнее разведение тест - культуры, вызывающее обесцвечивание метиленового синего через 1 час. В результате микробная нагрузка в пробирках уменьшается вдвое и соответствует «рабочей дозе» тест - культуры.
- 30. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре (37 ± 1) °С на 3-часовую экспозицию тест - культуры с антибиотиком. Затем в каждую пробирку добавляют по 2 см³ 1 %-ного мясо - пептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок вновь смешивают и инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в термостате.
- 31. Если в исследуемом объекте содержится антибиотик, то он блокирует дыхательные ферменты бактериальных клеток тест - культур и вызывает их гибель. В этих пробирках метиленовый синий не обесцвечивается (синий).
- 32. О степени активности антибиотика судят по его минимальной концентрации, которая вызывает полное подавление дегидрогеназ клеток тест - культур через 1 или 2 часа инкубации в термостате при температуре (37 ± 1) °С по сравнению с контролем.
- 8. Определение концентрации бензилпенициллина, стрептомицина и тетрациклина
- 33. Приготовление стандарта бензилпенициллина.
- 34. Приготовление стандарта стрептомицина.
- 35. Приготовление стандарта тетрациклина.
- 36. При активности стандарта тетрациклина 850 мкг/см³ в 10 мг навески содержится 8500 мкг антибиотика.
- 37. Для получения первого разведения основного раствора стандарта антибиотика в 1000 мкг устанавливают необходимый объем растворителя: 850 х 10 = 8500 : 1000 = 8,5 см³. Таким образом, навеску тетрациклина 10 мг растворяют в 8,5 см³ 0,01 Н HCI и получают концентрацию основного раствора 1000 мкг/см³. Приготовленный основной раствор может храниться в холодильнике в течение 7 дней.
- 38. Далее основной раствор 1000 мкг/см³ разводят десятикратно цитратно-солянокислым буфером, pH 6,0 - 6,2, до 100 и 10 мкг/см³. Все последующие разведения, готовят также на цитратно-солянокислом буфере, pH 6,0 - 6,2, и проводят расчеты активности стандарта тетрациклина аналогично схеме расчета по пенициллину и стрептомицину.
- 9. Определение концентрации антибиотиков в испытуемом растворе
- 39. Параллельно ставят второй ряд с двукратными разведениями испытуемого субстрата в пробирках с заранее разлитым мясо - пептонным бульоном в объеме 0,5 см³. Во все пробирки этого ряда также вносят 0,5 см³ взвеси, содержащей двойную «рабочую дозу» тест - культуры (то есть предпоследнее разведение тест - культуры, вызывающее полное обесцвечивание метиленового синего через 1 час инкубации в термостате). В результате микробная нагрузка уменьшается вдвое и соответствует «рабочей дозе» тест - культуры.
- 40. Таким образом, 1-я пробирка каждого ряда, контрольного и испытуемого, начинается с разведения 1 : 4.
- 41. Последняя пробирка не содержит испытуемого субстрата и служит контролем ферментативной активности тест - культуры.
- 42. Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 3-часовую экспозицию тест - культуры с антибиотиком. Затем для создания условий, близких к анаэробным, в каждую пробирку добавляют по 2 см³ 1 %-ного мясо - пептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют в термостате при температуре (37 ± 1) °С.
- 43. Учет результатов производят по тесту подавления антибиотиком дегидрогеназной активности тест - культуры через 1 или 2 часа инкубации в термостате (Таблица № 3 настоящих МУК).
- 44. Концентрацию антибиотика в исследуемом субстрате с неизвестным его количеством вычисляют путем умножения последнего разведения субстрата, подавляющего дегидрогеназную активность тест - культуры (Таблица № 3 настоящих МУК), на минимальную концентрацию антибиотика контрольного ряда стандарта, вызывающего тот же эффект (Таблица № 2 настоящих МУК).
- 45. В соответствии с Таблицей № 2 настоящих МУК, последнее разведение стандарта бензилпенициллина, которое вызывает полное подавление активности дыхательных ферментов тест - культуры, по сравнению с контролем, только через 2 часа инкубации в термостате и составляет 0,07 ЕД/см³. Через 1 час инкубации антибиотик вызывает лишь частичное подавление дегидрогеназной активности клеток.
- 46. Таким образом, концентрация пенициллина, вызывающая полное подавление дегидрогеназ клеток тест-культуры, соответствует 0,07 ЕД/см³ через 2 часа инкубации в термостате при температуре (37 ± 1) °С, аналогично Таблице № 3 настоящих МУК.
- 47. Учесть результат в данном опыте возможно только через 2 часа инкубации по полному подавлению дегидрогеназной активности клеток тест-культуры, которое наблюдается в разведении 1 : 8, так как через 1 час инкубации испытуемый субстрат вызывает лишь частичное подавление активности дыхательных ферментов тест-культуры по сравнению с контролем (Таблица № 3 настоящих МУК).
- 48. Содержание пенициллина в исследуемом субстрате вычисляют, умножив последнее разведение субстрата, подавляющее дегидрогеназную активность клеток тест-культуры, на минимальную концентрацию антибиотика контрольного ряда стандарта, вызывающего тот же эффект, т.е. 0,07 х 8 = 0,56 ЕД/см³. Таким образом, в испытуемом субстрате содержится 0,56 ЕД/см³ пенициллина.
- 10. Качественное определение антибиотиков
- 11. Растворы, реактивы, применяемые для разведения стандартов антибиотиков и испытуемых образцов
- 52. Бензилпенициллин.
- 53. Стрептомицин сульфат.
- 54. Рабочие разведения стандарта и экстракцию испытуемых образцов готовят на буфере № 4 - 0,066 М фосфатный (pH 7,8 - 8,0).
- 55. Тетрациклины.
- 56. Рабочие разведения стандарта и экстракцию испытуемых образцов готовят на буфере № 2 - цитратно-солянокислый (pH 5,8 - 6,0).
- 57. Мясо - пептонный бульон (выпускается в сухом виде и готовится согласно прилагаемой прописи на этикетке).
- 58. Мясо - пептонный агар (выпускается в сухом виде и готовится согласно прилагаемой прописи на этикетке).
- 59. 0,5 %-ный водный раствор метиленового синего.
- 60. 40 %-ный коммерческий раствор глюкозы.
Реквизиты документа
Полное наименование
О введении в действие МУК МЗ ПМР 4.2.026-13 «Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах»
Издатель
Министерство здравоохранения
Вид акта
Приказ
№ документа
№ 137
Редакция
Первоначальный документ
Дата документа
20.03.2013
Источник оф. опубликования
САЗ 13-13
Скачать
Доступно по тарифу
К карточке документа
Карточка документа
О введении в действие МУК МЗ ПМР 4.2.026-13 «Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах»
Тип:
Приказ
Номер:
№ 137
Статус:
Опубликован
Редакция:
Первоначальный документ
Организация:
Министерство здравоохранения
Дата:
20.03.2013